背景介绍：
Vero细胞又称为绿猴肾细胞，是一种非整倍性的非洲绿猴（属名：Chlorocebus）肾细胞系，年日本千叶大学的安村美博分离正常成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞并获得该细胞系。Vero细胞是连续的非整倍性细胞系，这意味着它的染色体数目异常，而作为连续细胞系，Vero细胞可以经过许多分裂周期而不老化。Vero细胞的干扰素分泌功能出现缺陷，与正常的哺乳动物细胞不同，它们在被病毒感染时不会分泌干扰素α/β。然而，它们仍然具有干扰素-α/β的受体，因此当将重组干扰素添加到其培养基中时，它们仍然可以作出反应。目前Vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制的研究、疫苗及重组蛋白的生产，并被看作是培养流感疫苗和研究病毒感染分子机制的理想细胞模型[1]。WHO批准其作为疫苗生产细胞，并建议将其作为流感疫苗生产的替代基质。
Vero细胞的具体应用
1.Vero细胞系是生产病毒载体和疫苗最常用的传代细胞系
Vero细胞系在限定代次内被认为是非致瘤性的，因此可用作研究疫苗的基质。年，Vero细胞被世界卫生组织批准，可用于生产人类疫苗的细胞系。Vero细胞已用于生产预防小儿麻痹症疫苗，狂犬病疫苗和ACAM天花疫苗等[2]。
2.Vero细胞可以进行广泛的细胞特性和大型细胞库的创建
Vero细胞系被分离后又衍生出几种亚细胞系，例如Vero81、Vero76和VeroE6。基因组分析表明，这些细胞起源于一种雌性的非洲绿猴。由于Vero细胞系可以无限传代，从而可用于广泛的细胞特性和大型细胞库的创建[3]。
3.Vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制研究
Vero细胞干扰素表达不足被认为是其对许多病毒都很敏感的原因之一，其中包括猿猴空泡病毒、麻疹病毒、风疹病毒、节足动物携带性病毒及腺病毒等；后来被发现也容易感染细菌毒素，包括白喉毒素、不耐热肠毒素和志贺氏样毒素等。它们在感染病毒后不分泌信号肽干扰素，因此细胞的抗病毒防御机制受损[3]。这一特性让Vero细胞被广泛应用于病毒学、细菌学、寄生虫学和毒理学[3]。
CRISPR/Cas9技术在Vero细胞中的应用
严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）是年新冠病毒（COVID-19）的病原体，它引发了这个世纪以来影响力最大的公共卫生危机。在写下这句话时，全球已经有超过万人被感染，超过42万人因感染而死亡，而当你看到这里时，这个数据还在增长着。一个有效的疫苗是人类打赢这场恶战的有力武器，而确定感染所必需的宿主因子，对于了解COVID-19的发病机制、揭示宿主易感性的变化以及确定新的宿主导向疗法（可能对当前和未来的大流行性冠状病毒有效）至关重要。而CRISPR-Cas9技术对于基因组的精准编辑能力让它成为了主要研究手段之一，源井生物也成功利用基于CRISPR-Cas9技术而优化的CRISPR-U技术对Vero细胞进行了基因编辑，由于CRISPR-U技术的基因敲除效率高达80%，因此利用CRISPR-U技术在Vero细胞中进行基因敲除相比于使用普通的CRISPR-Cas9技术具有更高的成功率。
Vero-E6细胞对SARS-COV-2感染和病毒诱导的细胞病变效应高度敏感，Wei,Jin等人在Vero-E6中进行了两个独立的全基因组CRISPR筛查，并且使用了两种不同Cas9核酸酶构建体（Cas9-v1和Cas9-v2）的Vero-E6系。他们评估了其中25个基因，包括亲病毒和抗病毒基因，见图1。他们发现亲病毒和抗病毒基因对理解COVID-19的发病机制、治疗方法和疫苗设计具有重要意义，例如SMARCA4可以促进肺泡上皮细胞的增殖，并防止肺纤维化（SARS-CoV和SARS-CoV-2的常见病症）[4]。
图1全基因组CRISPR筛选可识别对SARS-CoV-2诱导的细胞死亡至关重要的基因
在Vero细胞中基因编辑的具体案例
1.CRISPR/Cas9系统助力猪流行性腹泻病毒入侵和感染Vero细胞的研究
猪流行腹泻病毒(PEDV)是一种阳性单链病毒，属冠状病毒亚科的单链病毒属。氨肽酶N（APN或CD13）是一种Ⅱ型锌金属蛋白酶，可以介导多种细胞生理过程，包括抗原提呈、细胞分化、细胞运动和冠状病毒进入。由于猪APN（pAPN）是猪肠道致病α冠状病毒（TGEV）的主要受体，Ji,Chun-Miao等人通过基因敲除Vero细胞系中hAPN或pAPN的内源性表达，发现hAPN和pAPN都不是PEDV的功能受体。为了完全排除可能低于检测限的Vero细胞中有潜在的vAPN产生，他们使用CRISPR/Cas9系统生成vAPN敲除细胞，即利用两个gRNA/Cas9复合物靶向vAPN-CDS1，删除翻译起始位点下游-核苷酸之间的bp片段（图2），并通过IFA确认了这些敲除细胞Vero-vAPNKO1和Vero-vAPNKO2缺乏vAPN的表达（图3A）。研究结果显示在PEDV-GFP感染后，Vero-vAPNKO1和Vero-vAPNKO2细胞都表现出与正常Vero细胞相似的CPE和GFP的表达，这表明vAPN敲除对PEDV进入和感染没有影响[5]。
图2通过CRISPR/Cas9在Vero细胞中敲除vAPN基因
图3时间分辨免疫荧光
2.基因敲除Vero细胞可以帮助增强型RV疫苗底物的开发
轮状病毒（RV）是全球范围内引起严重胃肠炎的主要原因，Nichole等人使用siRNAs筛选对RV复制产生负面影响的宿主基因，然后通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除选定的基因。与野生型Vero细胞相比，完全测序的基因敲除Vero细胞底物可增加RV复制和RV疫苗抗原表达。结果表明，与其他受试Vero细胞底物相比，EMX2基因缺失的Vero细胞的RV复制和抗原产生更高。基因敲除Vero细胞可以促进增强型RV疫苗底物的开发，并为改进RV疫苗生产提供了帮助。
图43.使用CRISPR/Cas9系统在Vero细胞中敲入HSV病毒DNA基因组
细菌人工染色体（BACs）是控制DNA病毒（如疱疹病毒）大基因组的有力工具。因为这些DNA病毒（疱疹病毒）的基因组太大，无法克隆到质粒中。例如疱疹病毒(HSV)，一种常见的DNA病毒，基因组长度为kbp，可能会引起唇炎、生殖器疱疹和脑炎。但突变型HSV是肿瘤疗法的候选者，可以用于杀死肿瘤细胞。Suenaga等人使用CRISPR/Cas9系统和Vero细胞作为基质研究突变型HSV，这种方法无需将人工基因插入病毒基因组中，就能实现HSV的基因敲降与基因敲入，还提高了预期突变病毒克隆的分离效率。此外CRISPR/Cas9系统也可以应用于其他DNA病毒，如Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒和杆状病毒，对于研究各种类型的病毒，包括临床分离细胞株具有十分重要的作用[6]。
图5使用CRISPR/Cas9系统将基因特异性突变引入HSV-1基因组
迄今为止，源井生物已成功利用独家CRISPR-U技术体系对包括Vero细胞在内的超种的热门工具细胞进行了基因编辑，并在全球范围内提供成熟优质的基因编辑服务。目前我们的基因编辑产品/服务有：超种KO细胞现货、万条gRNA载体现货、细胞敲除服务、点突变/敲入服务、慢病毒包装服务、“单克隆级别”过表达/干扰稳转细胞株定制等，更多产品/服务尽在源井生物